RESUMEN
La presente investigación abordó el desarrollo de una técnica de enzimoinmunoensayo competitivo destinada a la detección de la presencia de trazas de nueces en matrices alimentarias libres de gluten. El método implementado se fundamentó en la utilización de un antisuero policlonal de conejo específico para proteínas de nuez como anticuerpo primario. Se procedió a la determinación de las concentraciones óptimas de antígeno a ser inmovilizado y de anticuerpo primario para la fase de competición. La curva de calibración se elaboró a partir de concentraciones crecientes de un extracto de nuez, obtenido mediante un protocolo de extracción con buffer Tris-HCl, SDS y sulfito. Los parámetros de validación evaluados arrojaron resultados adecuados. El enzimoinmunoensayo desarrollado se utilizó para el análisis de muestras comerciales de productos libres de gluten, cuyos resultados se compararon con los obtenidos mediante un kit ELISA comercial, evidenciándose diferencias cuantitativas entre ambos métodos. Se concluye que el enzimoinmunoensayo desarrollado presenta potencial para su aplicación como método de screening. Palabras clave: ELISA, proteínas de nuez, libre de gluten, harina de arroz, método de screening.
1. INTRODUCCIÓN
A nivel mundial, se estima que el 90 % de las alergias alimentarias son desencadenadas por ocho alimentos y sus derivados: leche, huevo, soja, trigo, maní, frutos secos, pescado y crustáceos (1). Una consulta de expertos FAO/OMS, organizada por los Comités del CODEX sobre Etiquetado de Alimentos e Higiene de los Alimentos, en el año 2020, estableció que los alérgenos prioritarios a nivel internacional son: cereales que contienen gluten (trigo y otras especies de Triticum, cebada y otras especies de Hordeum, centeno y otras especies de Secale y sus variedades híbridas), crustáceos, huevo, pescado, maní, leche, sésamo y frutos secos (avellanas, anacardos, nueces, pistachos, nueces pecanas y almendras) (2).
En Argentina la introducción del artículo 235 séptimo al Código Alimentario Argentino en 2017 significó la obligatoriedad de informar sobre la presencia de alérgenos en el etiquetado de los alimentos. (3). La obligatoriedad del etiquetado de alérgenos exige a los fabricantes de alimentos una gran atención. Para ello, se necesitan metodologías de detección de proteínas alergénicas, siendo la técnica de ELISA de uso habitual. La falta de producción local de los kits de ELISA y el alto costo de estos en Argentina representan un desafío. En este contexto, y dado que los frutos secos son alérgenos de declaración obligatoria, el objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica competitiva de inmunoensayo enzimático para la detección de trazas de nueces en productos libres de gluten.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MUESTRAS ANALIZADAS
2.1.1. NUEZ
Para preparar los sistemas modelo, se utilizó nuez (Juglans regia L.) previamente molida, para luego ser utilizada como antígeno para su inmovilización en la placa.
2.1.2.SISTEMAS MODELO DE HARINA DE ARROZ
Se prepararon sistemas modelo de harina de arroz con agregado de nuez. Los sistemas modelo contenían: 50, 100 y 130 ppm de proteína de nuez en mezcla con harina de arroz.
2.1.3. PRODUCTOS COMERCIALES
Se adquirieron aleatoriamente dieciséis productos comerciales, un envase de cada producto en diferentes mercados de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Se seleccionaron productos que declaraban nuez en la lista de ingredientes, otros que incluían frases de advertencia referidas a nuez y otros no declaraban nuez. Los productos libres de gluten analizados fueron galletas, alfajores y budines. Los mismos fueron homogeneizados. Cada producto comercial se molió en un procesador de alimentos. En la Tabla 1 se presentan la denominación de venta del producto, la lista de ingredientes y la declaración de alérgenos de las dieciséis muestras comerciales.
2.2. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DE NUEZ Y DE LOS SISTEMAS MODELO.
Se pesaron 80 mg de nuez molida y 200 mg de cada sistema modelo para la extracción de proteínas. El proceso de extracción consta de diferentes pasos:
• Dos mililitros de solución extractiva de proteína total fueron agregados a cada una de las muestras.
Esta solución contiene Tris-HCl 0,0625 M con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 3 % y sulfito (S) al 2 %.
• Los tubos se calentaron en un baño de agua a 100 °C durante 5 minutos. Tras 2 minutos en el baño, se agitó con una varilla.
• El contenido de los tubos de extracción se transfirió a tubos de plástico y se centrifugó a 3000 rpm durante 30 minutos.
• Los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.
Se utilizó el método de Lowry para la cuantificación de las proteínas de nuez en el extracto y para el cálculo de la recuperación (4).
2.3. OPTIMIZACIÓN DEL ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO
La optimización del enzimoinmunoensayo competitivo se basa en dos determinaciones: la concentración óptima de antígeno (nuez) para inmovilizar en la placa y la dilución óptima del anticuerpo primario (antisuero policlonal de conejo específico para proteínas de nuez) a utilizar en la competencia. Se utilizó antisuero policlonal obtenido de conejos inmunizados con nuez, según (5).
2.4. RECUBRIMIENTO DE LA PLACA
Se utilizaron placas de microtitulación Maxisorp®, NUNC, Dinamarca. Cien μL de dos concentraciones diferentes de antígeno fueron sembradas en cada pocillo. Las concentraciones fueron: 1 μg de proteína de nuez / 100 μL o 10 μg de proteína de nuez / 100 μL de Buffer carbonato/bicarbonato, pH: 9,6 (Buffer carbonato de sodio 0,015 M, bicarbonato de sodio 0,035 M, pH: 9,6). La placa se incubó utilizando una cámara húmeda y oscuridad, a una temperatura de 4 °C durante 24 h. Se lavó 5 veces con una solución de lavado (NaCl al 0,9 % p/v y Tween 20 al 0,0125 % v/v en agua). Se sembraron 200 μl de solución de bloqueo (gelatina bovina al 1 % p/v y Tween 20 al 0,1 % v/v en TBS) en cada pocillo. Se incubó durante una hora en cámara húmeda, y en oscuridad a una temperatura de 37 °C, con agitación. La placa se lavó 5 veces con la solución de lavado. Posteriormente, se sembraron 100 μL de diferentes diluciones del anticuerpo primario diluido con buffer TBS con Tween 20 al 0,1 % v/v y polietilenglicol al 3 %. Las diluciones del anticuerpo primario utilizadas se encontraban entre 1/2000 y 1/64000. En los pocillos correspondientes al blanco (blanco 1 y blanco 10) solo se sembró el buffer utilizado para la dilución del anticuerpo primario.

Se incubó durante una hora en cámara húmeda, en oscuridad a 37 °C con agitación. La placa se lavó 5 veces con la solución de lavado. Cien μl de anticuerpo secundario Anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina Bio-Rad (obtenido en cabras inmunizadas con IgG de conejo purificada) se sembraron en los pocillos. El anticuerpo secundario se diluyó 1:3000 con buffer TBS con 0,1 % v/v de Tween 20 y 3 % de polietilenglicol. Se incubó durante una hora en una cámara húmeda, en oscuridad a 37 °C con agitación. La placa se 5 veces con solución de lavado. Finalmente, se sembraron 100 μl de una solución que contenía 1 mg/mL de fosfato de paranitrofenilo en un buffer que contenía 10 % v/v de dietanolamina y 0,01 % de cloruro de magnesio, pH: 9,8. Se incubó 20 minutos en una cámara húmeda, en oscuridad a 37 °C con agitación. Se utilizó un lector de placas ELISA para determinar la absorbancia a 405 nm. Los valores de absorbancia se corrigieron con la absorbancia promedio correspondiente al blanco. Se trazaron las curvas de absorbancia corregida frente a ln 1/dilución del anticuerpo primario utilizando una hoja de cálculo de Microsoft Excel.
2.5. VALIDACIÓN DEL ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO PARA LA DETECCIÓN/ CUANTIFICACIÓN DE TRAZAS DE NUEZ EN PRODUCTOS LIBRES DE GLUTEN
2.5.1. LINEALIDAD
Fueron utilizadas concentraciones crecientes de un extracto de nuez con buffer Tris-HCl 0,0625 M, 3 % de SDS y 2 % de S, para determinar la linealidad del método. Dado que en este ensayo se utiliza un buffer de extracción que contiene agentes reductores y desnaturalizantes (S y SDS) que interfieren con la reacción antígeno-anticuerpo, se evaluó la dilución de la solución extractiva, que no afectara la unión antígeno-anticuerpo. De esta forma, los componentes de la solución extractiva se diluyeron 1:122 en todos los puntos de la curva. Las diluciones se realizaron en buffer carbonato/bicarbonato, pH 9,6. La curva contenía cinco puntos: 0; 0,01; 0,03; 0,1 y 0,3 μg de proteína de nuez/mL de buffer carbonato/bicarbonato, pH 9,6. Para cada punto de la curva se realizó una dilución del extracto original, manteniendo constantes las concentraciones de SDS y S. Se preincubaron 75 μL de la dilución del anticuerpo primario seleccionado en la optimización de la prueba y 75 μL de cada una de las diluciones de los puntos de curva previamente preparados. Además, se prepararon dos controles: un control inespecífico (I) con 200 μL del buffer utilizado para diluir el anticuerpo primario y un control de unión máxima (M) con 100 μL del buffer utilizado para diluir el anticuerpo primario y 100 μL del anticuerpo primario seleccionado en la optimización de la prueba.
Los preincubados se incubaron a 4 °C en una cámara húmeda y en oscuridad durante 24 h. Además, una placa ELISA se sensibilizó sembrando en la misma la concentración de antígeno (nuez) seleccionada previamente en la optimización de la prueba. Luego se incubó en una cámara húmeda, en la oscuridad a 4 °C durante 24 h. La placa se lavó 5 veces con solución de lavado. Se sembraron 200 μL de solución de bloqueo en cada pocillo y se incubaron durante una hora en una cámara húmeda, en la oscuridad a 37 °C, con agitación. La placa se lavó 5 veces con solución de lavado. Posteriormente, se sembraron 100 μL de los preincubados. Se incubó durante una hora en una cámara húmeda, en la oscuridad a 37 °C con agitación. La placa se lavó 5 veces con solución de lavado. El protocolo se siguió como se describió previamente en 2.4. Los valores de absorbancia se corrigieron con la absorbancia media correspondiente a I. Se construyó una curva de calibración de absorbancia, absorbancia corregida versus ln μg de proteína de nuez/mL. Para el análisis estadístico de los resultados se realizó un análisis de regresión lineal (6).
2.5.2. LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
Para determinar los límites de detección y cuantificación del método, se utilizó una muestra de harina de arroz sin analito (nuez). Esta muestra se extrajo cinco veces como se describió anteriormente en 2.2. Cada extracto se analizó por duplicado, preincubando las diluciones 1:122 con buffer carbonato/bicarbonato, pH: 9,6. La concentración de analito en cada muestra se calculó según la fórmula [1]. Se calculó el valor medio del analito para la muestra de harina sin analito y su desviación estándar correspondiente. El límite de detección se calculó como el valor medio más tres veces la desviación estándar. El límite de cuantificación se calculó como el valor medio más diez veces la desviación estándar.
La cantidad de proteína de nuez en μg/1000 mg de arroz se calcula según la siguiente fórmula:

- (1) μg de proteína de nuez interpolada en la curva de calibración.
- (2) Volumen del sobrenadante obtenido al extraer harina de arroz con solución extractiva de proteínas totales: 1000 μL (harina de arroz).
- (3) 1000 mg: para expresar el contenido en 1000 mg de harina de arroz.
- (4) 8,2 μL. Es el volumen de extracto tomado del sobrenadante y diluido 1:122. Posteriormente, 8,2 μL se diluyen a 1000 μL con buffer carbonato/ bicarbonato; pH 9,6.
- (5) P: 200 mg. Es el peso de los productos libres de gluten extraídos con solución extractiva de proteínas totales.
2.5.3. PRECISIÓN
Para evaluar la precisión intradía del método, se analizaron tres muestras de harina de arroz con la misma cantidad de analito (100 ppm de proteína de nuez), cada muestra se extrajo como se describió en 2.2.(n=3). Cada extracto se analizó por duplicado mediante el enzimoinmunoensayo competitivo, realizando una dilución 1:122 de cada muestra antes de la preparación de las preincubaciones. La concentración de analito en cada muestra analizada se determinó según la fórmula [1].
Para el procesamiento estadístico, se promediaron los valores de analito de las tres muestras y se calculó la desviación estándar y el coeficiente de variación (CV). Este CV corresponde a la precisión del método en el día.

Para evaluar la precisión interdías, se realizó el mismo procedimiento descrito previamente para la prueba intradiaria en tres días diferentes (n=9). Para el procesamiento estadístico, se calcularon la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los nueve valores obtenidos. El CV corresponde a la precisión del método entre días.
Se tomó como criterio de aceptación, que el CV de la precisión intradía y el CV de la precisión interdías no superaran el 15 % (7).
2.5.4. RECUPERACIÓN
Para evaluar la recuperación del método se analizaron tres sistemas modelo de harina de arroz que contenían 50, 100 y 130 ppm de proteína de nuez.
Los sistemas modelo se extrajeron por triplicado como se describió anteriormente. Se analizaron por duplicado, mediante una dilución 1:122 de cada muestra antes de la preparación de los preincubados.
La concentración de analito en cada muestra analizada se determinó según la fórmula [1]. Para cada sistema modelo, se promediaron los tres valores de analito nuez.
El porcentaje de recuperación se calculó mediante la fórmula que se describe a continuación:
% de recuperación = valor obtenido x 100 / valor real
- Valor obtenido: concentración de proteína de nuez obtenida al aplicar el enzimoinmunoensayo para SM de 50, 100 y 130 ppm de proteína de nuez.
- Valor real: 50, 100 y 130 ppm de proteína de nuez.
Se promediaron las recuperaciones de los tres sistemas modelo. Como valores adecuados se consideraron valores de recuperación entre 70-130 % (8).
2.6. KIT ELISA COMERCIAL
Los productos comerciales libres de gluten se analizaron con el enzimoinmunoensayo competitivo y con un kit comercial ELISA Eurofins-SENSISpec ELISA Walnut Gold Standard (9). Todas las muestras se analizaron por duplicado siguiendo los protocolos de este kit (9).
Límites de detección y de cuantificación del kit comercial: 0,4 ppm y 2,0 ppm de nuez respectivamente, con un rango de cuantificación de 2,0 a 60,0 ppm de nuez. Los resultados del kit comercial se expresan como nuez total.
3. RESULTADOS
3.1 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE NUEZ EN EL EXTRACTO
Se recuperó el 86 % de las proteínas de nuez solubles en la solución extractiva, obteniéndose una concentración de 6,0 mg/mL a partir de una concentración real de 7,0 mg/mL en el extracto de proteínas totales.
3.2. OPTIMIZACIÓN DEL ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO
En la Figura 1 se presentan las curvas resultantes de la optimización del ensayo, evaluando concentraciones de proteína de nuez de 1 μg/100 μL y 10 μg/100 μL en buffer carbonato/bicarbonato (pH 9,6). La curva que exhibió la mayor pendiente se seleccionó (1 μg/100 μL) como indicativa de la concentración óptima de antígeno para el ensayo. Para asegurar una sensibilidad adecuada, la dilución del anticuerpo primario para la competencia se estableció en la región de la curva de 1 μg/100 μL que demostró la mayor respuesta a los cambios en la concentración del analito, resultando en una dilución de 1/4000 (Ln(1/dilución) = 8,29).
3.3. VALIDACIÓN
3.3.1. LINEALIDAD
La linealidad se evaluó utilizando cinco concentraciones de proteína de nuez: 0; 0,01; 0,03; 0,1 y 0,3 μg/mL (Figura 2).
La linealidad del ensayo se evaluó mediante el software Infostat (versión 2004d.1), obteniéndose un valor de F de 106 (p < 0,0001). La línea obtenida presentó una pendiente de -0,0648 con un límite inferior del 95 % (LI) de -0,08 y un límite superior del 95 % (LS) de -0,05, un punto de corte de 0,6673 con LI: 0,63 y LS: 0,71, y un coeficiente de correlación de 0,9373. A partir de estos datos, se concluyó que el rango de concentración de proteína de nuez de 0,01 a 0,3 μg/mL mostró linealidad. La aplicación de la Fórmula [1] permitió calcular un rango de trabajo de 34 a 274 ppm de proteína de nuez en harina de arroz, el límite inferior representa el límite de cuantificación del ensayo en esta matriz.
3.3.2. LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
Los límites de detección y cuantificación del método para proteína de nuez en harina de arroz fueron 19,0 ppm y 34,0 ppm, respectivamente.
3.3.3. PRECISIÓN
La precisión intradía e interdías del método, evaluada como coeficiente de variación (CV), fue del 15 % (n=3) y 13 % (n=9) respectivamente. Estos valores se consideran adecuados.
3.3.4. RECUPERACIÓN
Sistemas modelo de harina de arroz conteniendo 50, 100 y 130 ppm de proteína de nuez fueron analizados para determinar la recuperación del método, la cual resultó ser del 107 %. Este valor de recuperación se considera adecuado.
3.4. ANÁLISIS DE PRODUCTOS COMERCIALES LIBRES DE GLUTEN
Los resultados obtenidos en el análisis de proteína de nuez en productos comerciales libres de gluten, utilizando tanto el kit SENSISpec ELISA Walnut Gold Standard como el Enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado, se presentan en la Tabla 1.
4. DISCUSIÓN

4.1. VALIDACIÓN
A pesar de que el enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado muestra valores de detección y cuantificación elevados en comparación con los kits comerciales, su valor reside en la confirmación de la presencia de nueces en muestras que arrojan resultados positivos.
La precisión intradía e interdía de los enzimoinmunoensayos competitivos para detectar proteína de nuez en harina de arroz fue igual o inferior al 15 %, cumpliendo con el criterio de aceptación (7), y los valores de recuperación se encontraron dentro del rango de referencia del 70-130 % (8).
4.2. ANÁLISIS DE PRODUCTOS COMERCIALES LIBRE DE GLUTEN
La presencia de alérgenos no declarados en alimentos, un problema documentado en numerosos estudios (10, 11), representa un riesgo significativo para la salud de los consumidores alérgicos. Investigaciones previas han evidenciado la alta prevalencia de esta problemática, independientemente de la presencia de advertencias.
Aunque el método ELISA se acepta como método estándar para la medición de alérgenos, estos resultados parecen variar entre fabricantes. Esta variación podría deberse a la falta de estandarización del método, el material de calibración utilizado, las soluciones de extracción empleadas o la especificidad de los anticuerpos (12). Por lo tanto, no es posible comparar los resultados cuantitativos entre el enzimoinmunoensayo competitivo y el kit de diagnóstico SENSISpec ELISA Walnut Gold Standard.
Tanto el enzimoinmunoensayo desarrollado como el kit comercial arrojaron resultados negativos (inferiores a sus respectivos límites de cuantificación) para la presencia de nuez en las muestras 5, 7, 8, 9, 11 y 12 que no la contenían/declaraban y en las que indicaban "puede contener nuez" 2, 3, 4, 10, 13 y 14. En la muestra 1, rotulada con la leyenda "puede contener nuez", el kit comercial arrojó una concentración de 19 ppm de nuez, mientras que el enzimoinmunoensayo competitivo no detectó el alérgeno, situándose por debajo de su límite de cuantificación (34 ppm). En contraste, el análisis de las muestras 6, 15 y 16, que declaraban la presencia de nuez, reveló concentraciones superiores a los límites superiores de las curvas de calibración para ambos métodos (enzimoinmunoensayo > 274 ppm; kit comercial > 60 ppm).
Estos resultados indican que, si una muestra arroja un resultado positivo con el enzimoinmunoensayo competitivo, no es necesario utilizar un kit ELISA comercial, ya que contiene nuez. El enzimoinmunoensayo desarrollado tiene un costo considerablemente menor que el de los kits comerciales. Por lo tanto, podría utilizarse como método de screening para analizar muestras en las que se sospeche un posible contacto cruzado con nuez. Si se obtienen resultados negativos con esta metodología, se debe confirmar con un kit ELISA comercial de sensibilidad adecuada para asegurar la ausencia de nuez (ejemplo: muestra 1).
La consulta de expertos FAO-OMS (2020-2023) identificó inconsistencias significativas en las metodologías analíticas para alérgenos alimentarios. Entre los problemas destacados se encuentran la carencia de métodos validados para la identificación y cuantificación de muchos alérgenos prioritarios en diversas matrices, la limitada disponibilidad de materiales y métodos de referencia, y las dificultades en la recuperación de proteínas alergénicas, especialmente tras el procesamiento. Los expertos recomendaron armonizar las unidades reportadas por los métodos y establecer límites de cuantificación significativamente inferiores a los niveles de acción. Finalmente, enfatizaron la necesidad de un esfuerzo continuo en el desarrollo de métodos analíticos confiables para la detección y cuantificación precisa de alérgenos en diferentes alimentos (13).
Es necesario el desarrollo de métodos analíticos adecuados para la detección y cuantificación correcta de los alérgenos alimentarios en diferentes matrices alimentarias.
CONCLUSIONES
El desarrollo de métodos para detectar alérgenos en alimentos es crucial para autoridades sanitarias, la industria y consumidores. Para el screening de trazas de proteína de nuez en productos libres de gluten, los enzimoinmunoensayos desarrollados serían una opción adecuada. Un resultado positivo confirmaría la presencia de nuez, mientras que un resultado negativo requeriría confirmación con un kit ELISA comercial más sensible.
Referencias: ________________________________________________________
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(3) Código Alimentario Argentino. Capítulo V. Disponible en línea: https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/anmat_caa_capitulo_v_ rotulacion_actualiz_2021-09.pdf (consultado el: 15/03/25).
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